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MHC 四聚体(MHC Tetramer)

由于TCR MHC-抗原肽复合物之间的亲和力低,半衰期短,相互结合后容易快速脱落,重组的可溶性MHC-抗原肽复合物单体并不适合用于抗原特异性的T细胞检测。MHC四聚体技术(MHC Tetramer Technology)提供了一种快速、简便的检测抗原特异性T细胞(antigen-specific T cells)的方法,MHC四聚体分两类:MHC-I四聚体和MHC-II四聚体。

MHC-Ⅰ类四聚体

纯化获得的重组人MHC(重链)和人β2微球蛋白(β2m)与过量的810个氨基酸组成的肽段(特异性抗原)一起孵育,共复性,折叠形成MHC-抗原肽单体,并经高效液相质谱(HPLC)纯化。纯化后的MHC-抗原肽单体通过BirA酶(生物素连接酶)催化在其MHC重链C-端共价结合上一个生物素(Biotin)分子,即MHC-抗原肽-生物素单体,再经过链霉亲和素-琼脂糖亲和层析柱(Sreptavidin–agarose Afinity Clumn Cromatography)纯化,最后与已标记有荧光染料FITCPE或者APC的链霉亲和素结合,因为一分子链霉亲和素正好与四分子生物素相结合,故形成(MHC-抗原肽-生物素)4-链霉亲和素聚合物,即抗原特异性的MHC-Ⅰ四聚体。

MHC-类四聚体

MHCⅡ类分子是由α链和β链以非共价键形成的异二聚体。与I类分子不同,两条链均具多态性,因此,在体外构建可溶性MHCⅡ类分子四聚体要复杂的多。多数MHCⅡ类分子四聚体采用由昆虫细胞表达的重组蛋白所构建。首先在其α、β链的C端分别加上酸性和碱性亮氨酸拉链基序,且C端与亮氨酸拉链之间有15个氨基酸残基的连接蛋白;β链上还要通过7个氨基酸残基的间隔加上可生物素化的底物肽(BSP)。经大量表达、分离纯化和生物素化后,在体外酸性条件下与特异性抗原肽形成MHC-肽复合物,最后与荧光素(PE)标记的链霉亲和素混合形成四聚体。

四聚体制备流程.png

MHC四聚体制备(以MHC-I四聚体为例)

纯化获得的重组人MHC(重链)和人β2微球蛋白(β2m)与过量的810个氨基酸组成的肽段(特异性抗原)一起孵育,共复性,折叠形成MHC-抗原肽单体,并经高效液相质谱(HPLC)纯化。纯化后的MHC-抗原肽单体通过BirA酶(生物素连接酶)催化在其MHC重链C-端共价结合上一个生物素(Biotin)分子,即MHC-抗原肽-生物素单体,再经过链霉亲和素-琼脂糖亲和层析柱(Sreptavidin–agarose Afinity Clumn Cromatography)纯化,最后与已标记有荧光染料FITCPE或者APC的链霉亲和素结合,因为一分子链霉亲和素正好与四分子生物素相结合,故形成(MHC-抗原肽-生物素)4-链霉亲和素聚合物,即抗原特异性的MHC-I四聚体。



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